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關(guān)于biontex無支原體的細(xì)胞培養(yǎng)解答

更新時間：2021-12-10

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關(guān)于biontex無支原體的細(xì)胞培養(yǎng)解答

無支原體工作試劑

支原體污染一直是細(xì)胞生物學(xué)研究面臨的主要問題之一，因為它們會影響或改變細(xì)胞的生理機能。由于其寄生特性和適應(yīng)宿主細(xì)胞的能力，支原體經(jīng)常作為污染物出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)物中。 [1]

支原體沒有細(xì)胞壁。出于這個原因，它們對靶向細(xì)菌細(xì)胞壁合成的抗生素（例如pen/strep）不敏感，這些抗生素通常用于細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞壁的缺乏以及它們的小尺寸（通常為 0.2 - 0.3 ?m）也使它們在傳統(tǒng)顯微鏡下的檢測變得復(fù)雜。它們的小尺寸和非常靈活的形式也意味著支原體不能通過無菌過濾從液體介質(zhì)中去除。

由于缺乏宏觀效應(yīng)，支原體可能長期未被發(fā)現(xiàn)。特別是在使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素的日常工作中，實驗室工作人員的支原體污染可能會在很長一段時間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)，因為其他細(xì)菌的污染通過添加抗生素而被選擇性抑制，而同時引入的支原體可以不受阻礙地繁殖。

鑒于此，許多研究表明細(xì)胞培養(yǎng)物的支原體污染水平高達(dá) 40% 也就不足為奇了。這些高污染水平的一個可能原因被認(rèn)為是由實驗室工作人員、血清或胰蛋白酶、外來細(xì)胞培養(yǎng)物（交叉污染）或最終由收獲細(xì)胞培養(yǎng)物的動物引入的。 [3]

文獻(xiàn)：
1. HG Drexler, C. Uphoff；Cytotechnology 39(2), 75 – 90 (2002) [PubMed ID: 19003295]
2. 照片：M. Rohde, GBF, Braunschweig; C. Uphoff, DSMZ, Braunschweig
3. T. Lindl, J. Bauer：“Zell- und Gewebekultur"；Gustav Fischer 出版社，斯圖加特 (1987)；RJ Hay、ML Macy、TR Chen；Nature 339, 487 (1989) [PubMed ID: 2725683]

由于污染的存在會影響從細(xì)胞培養(yǎng)中獲得的結(jié)果的準(zhǔn)確性，或者在最壞的情況下，會損害細(xì)胞生長到整個培養(yǎng)物丟失的程度，因此必須定期檢查細(xì)胞培養(yǎng)物中是否存在支原體污染。特別是在細(xì)胞轉(zhuǎn)染中必須排除支原體污染，因為污染對細(xì)胞生長和代謝的負(fù)面影響會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率急劇下降。

微小的原因 - 主要的影響：支原體

支原體是軟體菌類中的幾個細(xì)菌屬之一。軟體動物是人類、動物和植物的微小寄生蟲或共生體；根據(jù)定義，支原體屬的 100 多種*物種僅限于脊椎動物宿主，在那里它們被稱為許多疾病的病原體（例如由肺炎支原體引起的肺炎）。

細(xì)胞表面支原體菌落的電子顯微鏡圖像

細(xì)胞表面支原體菌落的電子顯微鏡圖像 [2]

支原體細(xì)胞非常小，沒有細(xì)胞壁。因此，它們不受靶向細(xì)胞壁合成的抗生素的影響。支原體的基因組大小范圍為 0.58 – 1.38 兆堿基對，GC 含量低 (18 – 40 mol%)，是所有具有自動復(fù)制能力的原核生物中最小的。

作為需氧或兼性厭氧生物，支原體與其宿主理想地對齊，因此因此在細(xì)胞培養(yǎng)物 (37°C) 中找到最佳生長條件。

支原體...

...損害細(xì)胞生長
...降低宿主細(xì)胞的代謝活性
...調(diào)節(jié)細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生
...在體外誘導(dǎo)染色體畸變
...通過標(biāo)準(zhǔn)無菌過濾器
...對抗生素如青霉素或鏈霉素具有抗性通常用于細(xì)胞培養(yǎng)
...耐高溫和脫水
...影響轉(zhuǎn)染效率

支原體污染：

支原體可以在幾乎所有已知的細(xì)胞類型中增殖，因此無處不在。據(jù)估計，大約 80% 的日本細(xì)胞培養(yǎng)物、65% 的阿根廷細(xì)胞培養(yǎng)物和 15% 的美國細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 細(xì)胞生長的廣泛影響。

支原體污染對轉(zhuǎn)染效率的影響：

由于支原體污染具有不可見且不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡的特殊特性，因此污染可能會在很長一段時間內(nèi)未被發(fā)現(xiàn)。然而，這些細(xì)菌對轉(zhuǎn)染成功有廣泛的影響：

• 由于精氨酸需求增加，細(xì)胞生長顯著減少
• 支原體調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生
• 支原體導(dǎo)致染色體畸變
• 支原體滯留在細(xì)胞膜中，并可能調(diào)節(jié)細(xì)胞膜過程，例如內(nèi)吞作用。

所有這些操縱的生理過程也參與轉(zhuǎn)染過程。該圖顯示了支原體污染對 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞的廣泛影響：與未污染細(xì)胞相比，效率分別提高了 17% 和 5.6%。

在 48 孔板上用 pCMV?gal 轉(zhuǎn)染 HeLa 和 HepG2 細(xì)胞。通過 ONPG 和 BCA 分析評估比吸收值。左邊的條形顯示由支原體污染導(dǎo)致的轉(zhuǎn)染效率大大降低。

支原體檢測的常規(guī)方法

DAPI染色

在細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測支原體的一個流行應(yīng)用是用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色細(xì)胞。DAPI 強烈嵌入 DNA 的小溝中，并在紫外線激發(fā)下在最大 460 nm 處顯示出相對較寬的熒光發(fā)射。在無支原體細(xì)胞培養(yǎng)中，僅標(biāo)記細(xì)胞核。如果存在支原體細(xì)胞，它們的 DNA 也會被標(biāo)記。由于它們的體積小，單個支原體細(xì)胞無法在熒光顯微鏡下分辨：只有高度污染會導(dǎo)致可見的模糊面紗形成，這可能無法清楚地識別。

聚合酶鏈反應(yīng)

更靈敏的支原體檢測方法是 PCR。可以在非常早期的污染和低濃度狀態(tài)下檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中的支原體。這種檢測方法通常適用于細(xì)胞培養(yǎng)工作。

其他

雖然 ELISA 測試經(jīng)常用于支原體的常規(guī)檢測，但這種方法在靈敏度和特異性方面并不優(yōu)于 DAPI 測試。另一種方法是電子顯微鏡，然而，它需要先進(jìn)的設(shè)備并且更耗時。

結(jié)論

為確保細(xì)胞培養(yǎng)物中支原體污染引起的諸多問題最終成為過去，Biontex 提供了一系列基于 PCR 的檢測支原體檢測試劑盒：
MycoSPY®（常規(guī) PCR 檢測試劑盒）
MycoSPY® Master Mix（ PCR 檢測試劑盒，包括 Master Mix 和用于凝膠電泳的上樣緩沖液和示蹤染料

該產(chǎn)品對已建立的細(xì)胞系和原代細(xì)胞均取得了優(yōu)異的結(jié)果。

MycoSPY® 和 DAPI 染色在支原體檢測中的比較



用 DAPI 染色的 Cos7 細(xì)胞，無支原體污染。只有細(xì)胞核被染色。	DAPI 染色未能揭示這些 HepG2 細(xì)胞的支原體污染。

當(dāng)存在* 水平的支原體污染時，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細(xì)胞僅在細(xì)胞外圍顯示出微弱的可識別顏色。	所有這三種細(xì)胞系的可靠證據(jù)僅由 MycoSPY® 提供。 500 bp 條帶顯示了支原體污染的明確證據(jù)。在大量污染的情況下（第 3 道），無法再檢測到 700 bp 的內(nèi)部對照。

方法	DAPI-測試	酶聯(lián)免疫吸附試驗	MycoSPY®	電子顯微鏡
努力	+	+	+	--
費用	++	0	+	--
靈敏度	--	-	++	+
全部的	+	0	++++	--－

從受污染的細(xì)胞培養(yǎng)物中清除支原體

對于被細(xì)菌污染的細(xì)胞培養(yǎng)物的處理，通常使用標(biāo)準(zhǔn)抗生素。但是作用于細(xì)胞壁的抗生素（如青霉素）對支原體無效。
因此，我們提供產(chǎn)品MycoRAZOR®，這是一種抗生素混合物，可損害蛋白質(zhì)生物合成（轉(zhuǎn)錄和翻譯）。

經(jīng)常問的問題

? MycoSPY® 和 MycoSPY® Master Mix 試劑盒有什么區(qū)別？

關(guān)于套件的性能，沒有區(qū)別。所述MycoSPY®試劑盒是一個經(jīng)典的PCR試劑盒與單個組分（的Taq聚合酶，PCR緩沖液的dNTP與，引物混合物），其具有前PCR進(jìn)行混合。不包含用于凝膠電泳的加載緩沖液和示蹤染料。MycoSPY® Master Mix套件更易于處理和運輸。凍干的 Mastermix 包含為 PCR 和隨后的凝膠電泳預(yù)先混合的所有必要成分。用水（包括在套件中）重新配制后，工作流程非常簡單（參見MycoSPY® Master Mix）。Mastermix Kit 更穩(wěn)定，因此可以在室溫下運輸。

? 每次標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用 MycoRAZOR®（3 次）后是否必須進(jìn)行支原體檢測？

是的。重要的是檢查支原體是否已被MycoRAZOR®（例如，通過使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）*消除，以防止產(chǎn)生耐藥性。由于耐藥性的產(chǎn)生方式與所有抗生素的使用方式相同，因此*消除支原體至關(guān)重要。

? 在 MycoRAZOR® 的一個應(yīng)用周期（3 代）后，支原體檢測顯示陽性結(jié)果。我應(yīng)該采取什么行動？

首先檢查是否在上次使用MycoRAZOR®和當(dāng)前測試之間進(jìn)行了兩次未使用MycoRAZOR®的傳代。如果不是這種情況，則可能已檢測到死支原體，特別是通過高度敏感的方法，例如 PCR。如果觀察到最后一次應(yīng)用和測試之間的最短時間，請在接下來的五次細(xì)胞傳代中使用MycoRAZOR®，逐漸增加MycoRAZOR®的劑量，最大稀釋度為 1/25。請注意，根據(jù)細(xì)胞類型，增加MycoRAZOR®的濃度可能會產(chǎn)生毒性作用. 如果您在細(xì)胞中觀察到毒性作用（增殖率降低；細(xì)胞形態(tài)變化），請在剩余周期中使用最后一次使用的劑量。必須使用支原體檢測試劑盒（例如MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix）測試每種治療的結(jié)果！

? 在成功使用 MycoRAZOR® 并測試無支原體后，培養(yǎng)物進(jìn)一步受到支原體污染。這怎么發(fā)生的？

細(xì)胞培養(yǎng)中使用的動物產(chǎn)品是支原體污染的主要來源。為避免這種風(fēng)險，請僅使用保證不含支原體的胎牛血清 (FBS) 和胰蛋白酶。
支原體屬于 Mollicutes 類，因此缺乏細(xì)胞壁，它們對許多攻擊細(xì)胞壁合成的抗生素具有抗性。因此，在將此類抗生素（例如青霉素/鏈霉素）用于細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)使用中，使用者本身是重要的污染源。在這種情況下，非無菌工作條件會被忽視，因為添加抗生素會阻止大多數(shù)細(xì)菌的生長——從而阻止宏觀效應(yīng)——同時允許支原體不受阻礙地繁殖。
此外，來自另一種細(xì)胞培養(yǎng)物的交叉污染是可能的。出于這個原因，始終測試所有培養(yǎng)的細(xì)胞并更換任何可能被污染的細(xì)胞培養(yǎng)材料（培養(yǎng)基、FBS、胰蛋白酶、緩沖液）。

? MycoRAZOR® 是否含有強力霉素或四環(huán)素類抗生素？

第MycoRAZOR®不包含任何doxy-或四環(huán)素類抗生素。

? 許多基于 PCR 的商業(yè)支原體檢測試劑盒包括陽性對照和內(nèi)部對照。有什么區(qū)別？

大多數(shù)基于 PCR 的支原體檢測試劑盒都包含一個質(zhì)粒作為陽性對照，該質(zhì)粒編碼支原體的 16S rRNA。這確保了引物的功能。如果存在支原體污染，該質(zhì)粒產(chǎn)生的 DNA 擴增子的大小與預(yù)期的相同或相似。因此，帶有陽性對照的 PCR 必須在單獨的管中進(jìn)行。通常還包括內(nèi)部對照，以確保 PCR 不受來自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片的抑制。內(nèi)部對照產(chǎn)生與支原體污染的細(xì)胞樣本不同長度的 DNA 擴增子。因此，內(nèi)部控制可以在每種方法中進(jìn)行。

? 為什么 MycoSPY® Kit 或 MycoSPY® Master Mix Kit 中沒有陽性對照？

MycoSPY® Master Mix試劑盒和MycoSPY®試劑盒中包含的內(nèi)部對照是一種質(zhì)粒，它編碼支原體 16S rRNA 的縮短形式。因此，內(nèi)部對照用作陽性對照，并確保對于每種 PCR 方法，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中不存在抑制劑。因此，它排除了假陰性結(jié)果。

? MycoSPY® 或 MycoSPY® Master Mix Kit 的靈敏度是多少？

兩者MycoSPY®主混合物的試劑盒和MycoSPY®試劑盒檢測至少80份支原體基因組的。內(nèi)部控制稍微降低了靈敏度。由于支原體在細(xì)胞培養(yǎng)物受到污染后繁殖相對較快，因此這種敏感性就足夠了。
因此，我們建議在每次 PCR 中添加內(nèi)部對照，以確保不存在來自細(xì)胞培養(yǎng)上清液的任何現(xiàn)有抑制劑（蛋白質(zhì)、細(xì)胞碎片）。

? 要使用 MycoSPY® 或 MycoSPY® Master Mix Kit 檢查的細(xì)胞是用抗生素培養(yǎng)的。進(jìn)行檢測時使用不含抗生素的培養(yǎng)基會更好嗎

沒有必要避免使用常規(guī)抗生素，例如青霉素、鏈霉素或慶大霉素，因為它們不會抑制MycoSPY® Master Mix Kit 或MycoSPY®試劑盒的檢測。

? 是否可以儲存細(xì)胞培養(yǎng)上清液以使用 MycoSPY® 或 MycoSPY® Master Mix Kit 進(jìn)行檢查？

是的。我們建議在 20°C 下儲存，不含添加劑（例如 DMSO）。解凍后，應(yīng)按照手冊中的說明制備細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

? 在使用新鮮解凍的細(xì)胞使用 MycoSPY® 或 MycoSPY® Master Mix 進(jìn)行檢測之前，建議的等待時間是多少？

我們建議將細(xì)胞培養(yǎng)至少 48-72 小時，或直到生長區(qū)域的覆蓋率至少達(dá)到 80%。對于懸浮細(xì)胞，細(xì)胞密度應(yīng)大約在推薦用于傳代培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)。由于在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中檢測到支原體，因此在此期間不應(yīng)更換培養(yǎng)基。

? 我應(yīng)該多久檢測一次支原體？

我們建議至少每 1-2 個月進(jìn)行一次支原體 PCR（例如使用MycoSPY®或MycoSPY® Master Mix），尤其是在存在抗生素（例如 pen/strep）的情況下培養(yǎng)細(xì)胞時。這些抗生素可防止發(fā)現(xiàn)未消毒的工作技術(shù)，但會導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)物受到支原體污染。

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用 DAPI 染色的 Cos7 細(xì)胞，無支原體污染。只有細(xì)胞核被染色。	DAPI 染色未能揭示這些 HepG2 細(xì)胞的支原體污染。

當(dāng)存在* 水平的支原體污染時，這些 DAPI 染色的 H441-Luc 細(xì)胞僅在細(xì)胞外圍顯示出微弱的可識別顏色。	所有這三種細(xì)胞系的可靠證據(jù)僅由 MycoSPY® 提供。 500 bp 條帶顯示了支原體污染的明確證據(jù)。在大量污染的情況下（第 3 道），無法再檢測到 700 bp 的內(nèi)部對照。